All prerequisites, links to material and slides for this course can be found on github. At this point hopefully everyone has installed the required packages listed on our homepage.
Or can be downloaded as a zip archive from here.
Many of the raw and intermediate files can be found on DropBox.
Once the zip file in unarchived. All presentations as HTML slides and pages, their R code and HTML practical sheets will be available in the directories underneath.
We will use the 8k Human PBMC data from 10X genomics. We will be using the filtered dataset that has been produced by Cell Ranger.
download.file("https://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/2.1.0/pbmc8k/pbmc8k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz",
"pbmc8k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz")
We can check the contents of the directory with the
dir()
command. We should see our our unpacked directory
filtered_feature_bc_matrix
and the original tar.gz
file.
## [1] "dgCMatrix" "CsparseMatrix" "dsparseMatrix" "generalMatrix"
## [5] "AnyMatrix" "V3Matrix" "dMatrix" "sparseMatrix"
## [9] "compMatrix" "Matrix" "replValueSp"
## 6 x 8381 sparse Matrix of class "dgCMatrix"
## [[ suppressing 8381 column names 'AAACCTGAGCATCATC-1', 'AAACCTGAGCTAACTC-1', 'AAACCTGAGCTAGTGG-1' ... ]]
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## RP11-34P13.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## FAM138A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## OR4F5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-34P13.14 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
As an alternative we can use Read10X_h5 function to read cellranger matrix from an .h5 file. This format is often used by python packages.
The matrix is loaded into Seurat object with CreateSeurtObject()
Cut-offs: + min_gene: minimum genes detected per cell: cells with too few genes detected + min_cell: minimum cells a gene expressed in: Remove genes expressed in too few cells
We typically add sample information as this will add clarity later when we think about multi-sample comparisons.
You will notice throughout this workflow we will keep assigning back to the same Seurat object as we update and modify the object as we process our data.
We can look at the Seurat object to get information about the dataset.
## An object of class Seurat
## 15446 features across 8381 samples within 1 assay
## Active assay: RNA (15446 features, 0 variable features)
## 1 layer present: counts
## orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA dset
## PBMC_8k_AAACCTGAGCATCATC-1 PBMC_8k 2391 868 PBMC_8k
## PBMC_8k_AAACCTGAGCTAACTC-1 PBMC_8k 1694 806 PBMC_8k
To do this in Seurat we have 3 functions: * log normalization with NormalizeData() * Identify Variable Features with FindVariableFeatures() * Scale Data with ScaleData()
When using the NormalizeData() function we use the defaults for the normalization method and scale factor.
## Normalizing layer: counts
Next we use FindVariableFeatures() with the default VST method. We can select the number features we want to identify. These will be the most variable. In this case we are taking 3000.
## Finding variable features for layer counts
Scales and center features in the dataset
## Centering and scaling data matrix
## When using repel, set xnudge and ynudge to 0 for optimal results
In our simplified workflow we used a log normalization approach. Recently an alternative approach has been gaining popularity: SCTransform. Lets compare this back to our log normalization.
## An object of class Seurat
## 30892 features across 8381 samples within 2 assays
## Active assay: SCT (15446 features, 3000 variable features)
## 3 layers present: counts, data, scale.data
## 1 other assay present: RNA
The normalized data is stored in assay SCT. We can see this is now the active assay. The log results are stored in the RNA assay. We can control which is the active assay with the DefaultAssay() function.
We can extract out the results of our normalized and scaled data with the GetAssayData() function.
We can test the concordance with Spearman’s correlation.
library(ggplot2)
dat <- data.frame(logNorm = log_avgExp, SCT = sct_avgExp)
cor_val <- cor.test(log_avgExp, sct_avgExp, method = "spearman")
ggplot(dat, aes(x = logNorm, y = SCT)) + geom_point() + geom_smooth() + labs(x = "Log_Normalization",
y = "SCTransform", subtitle = paste0("rho=", round(cor_val$estimate, 3), "; p-value=",
cor_val$p.value[1])) + theme_classic()
We can see there is very high similarity between the results.
## Warning in cor.test.default(log_avgExp, sct_avgExp, method = "spearman"):
## Cannot compute exact p-value with ties
## `geom_smooth()` using method = 'gam' and formula = 'y ~ s(x, bs = "cs")'
At this point, in theory we should have a nice clean dataset, so we can start pushing towards the biological questions in our dataset.
scRNAseq is highly dimensional data. To be able to tackle our data with approaches like clustering we need to simplify it down with dimension reduction. There are several steps:
Perform PCA with RunPCA() function in Seurat. Set Principle components to 50.
## PC_ 1
## Positive: CST3, LYZ, MNDA, CSTA, TYROBP, LST1, FCN1, FTL, AIF1, CTSS
## FCER1G, TYMP, S100A9, RP11-1143G9.4, LGALS1, FTH1, S100A8, LGALS2, SERPINA1, SPI1
## S100A11, FGL2, PSAP, GRN, CFD, GPX1, AP1S2, MS4A6A, CLEC7A, VCAN
## Negative: LTB, TRAC, RPS18, CD3D, EEF1A1, IL32, TRBC2, CD69, LDHB, CD3G
## IL7R, CD27, CD7, IFITM1, RPS2, CD2, LEF1, CCR7, TRBC1, SPOCK2
## NOSIP, FLT3LG, LINC00861, CD247, TRAT1, LDLRAP1, CD6, DNAJB1, MAL, CTSW
## PC_ 2
## Positive: IL32, CD3D, TMSB4X, CTSW, CD7, TRAC, NKG7, GZMA, S100A4, CST7
## IFITM1, CCL5, GZMM, CD247, ANXA1, PRF1, CD2, KLRD1, CD3G, PFN1
## SRGN, KLRB1, ITGB2, S100A6, ID2, HOPX, IL7R, LYAR, KLRG1, GNLY
## Negative: CD79A, MS4A1, IGHM, IGHD, CD79B, TCL1A, IGKC, LINC00926, BANK1, CD22
## CD74, HLA-DQB1, HLA-DRA, HLA-DPA1, VPREB3, TNFRSF13C, FCER2, HLA-DPB1, MEF2C, FAM129C
## RALGPS2, HLA-DRB1, HLA-DOB, HLA-DQA1, FCRLA, EAF2, SPIB, HVCN1, HLA-DMB, TSPAN13
## PC_ 3
## Positive: GZMB, NKG7, PRF1, CST7, KLRD1, GZMA, CLIC3, FGFBP2, KLRF1, GNLY
## HOPX, SPON2, C12orf75, CD160, CCL5, RHOC, CTSW, CCL4, GZMH, FCGR3A
## XCL2, MATK, CMC1, TRDC, S1PR5, ADGRG1, APOBEC3G, PLEK, IL2RB, CLIC1
## Negative: RPLP1, LEF1, CCR7, RPS18, RPS24, RPS2, MAL, S100A12, LDHB, ACTN1
## EEF1A1, S100A8, VCAN, TRABD2A, JUNB, S100A9, RP11-1143G9.4, CD14, TRAC, LDLRAP1
## SERINC5, NOSIP, LRRN3, RGCC, LTB, FCN1, IL7R, FOS, RBP7, CSTA
## PC_ 4
## Positive: LILRA4, SERPINF1, LRRC26, IL3RA, CLEC4C, SCT, PLD4, PPP1R14B, TPM2, DERL3
## ITM2C, PTCRA, DNASE1L3, LINC00996, TNFRSF21, GAS6, FCER1A, LAMP5, SMPD3, UGCG
## MAP1A, PTPRS, RP11-73G16.2, JCHAIN, MYBL2, CCDC50, SCAMP5, ASIP, IRF7, LILRB4
## Negative: KLRD1, NKG7, CST7, FGFBP2, PRF1, KLRF1, GZMA, GNLY, CCL4, HOPX
## CD160, MS4A1, IGHD, CD79B, CD79A, SPON2, LINC00926, MT-CO3, XCL2, MT-CO1
## TRDC, S1PR5, GZMH, FCER2, MATK, ADGRG1, TTC38, FCGR3A, CCL5, CMC1
## PC_ 5
## Positive: RPS2, EEF1A1, CDKN1C, HES4, TMSB10, RPS18, SIGLEC10, CSF1R, BATF3, TCF7L2
## FCGR3A, CORO1A, SLC25A6, LRRC25, RPLP1, MS4A4A, ABI3, YBX1, HCK, WARS
## MS4A7, RNASET2, JUNB, HLA-DQA1, NEURL1, ENHO, CSTB, RP11-1008C21.1, ANXA2, CLIC2
## Negative: SDPR, PPBP, GNG11, PF4, TUBB1, SPARC, CLU, HIST1H2AC, GP9, ACRBP
## CTTN, TMEM40, C2orf88, CMTM5, ITGA2B, TSC22D1, MAP3K7CL, NRGN, HRAT92, MMD
## CLDN5, PTCRA, HGD, TREML1, HIST1H2BJ, CD9, MYLK, SH3BGRL2, GMPR, LCN2
Typically we want to balance having enough/not too many groups with the most variance explained by the groups, to get the most parsimonious results. We use elbow plots to find an inflection point.
We can use cutoffs to derive this computationally based on: * How low variation is. * How much variation has already been described. * The rate of change in variation between PCs.
We can use cutoffs to derive this computationally based on: * How low variation is. * How much variation has already been described. * The rate of change in variation between PCs.
# Determine which PC exhibits cumulative percent greater than 90% and %
# variation associated with the PC as less than 5
co1 <- which(cumu > 90 & pct < 5)[1]
# Determine the difference between variation of PC and subsequent PC, last
# point where change of % of variation is more than 0.1%.
co2 <- sort(which((pct[1:length(pct) - 1] - pct[2:length(pct)]) > 0.1), decreasing = T)[1] +
1
pc <- min(co1, co2)
pc
## [1] 17
We can now look at our cutoff on our elbow plot.
We can now look at our cutoff on our elbow plot. This seems to match the point where our data plateaus.
## Computing nearest neighbor graph
## Computing SNN
## 16:38:30 UMAP embedding parameters a = 0.9922 b = 1.112
## 16:38:30 Read 8381 rows and found 17 numeric columns
## 16:38:30 Using Annoy for neighbor search, n_neighbors = 30
## 16:38:30 Building Annoy index with metric = cosine, n_trees = 50
## 0% 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100%
## [----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|
## **************************************************|
## 16:38:31 Writing NN index file to temp file /tmp/RtmpxXE8Nv/file31c6d8848c4
## 16:38:31 Searching Annoy index using 1 thread, search_k = 3000
## 16:38:33 Annoy recall = 100%
## 16:38:34 Commencing smooth kNN distance calibration using 1 thread with target n_neighbors = 30
## 16:38:36 Initializing from normalized Laplacian + noise (using RSpectra)
## 16:38:36 Commencing optimization for 500 epochs, with 353242 positive edges
## 16:38:44 Optimization finished
We can now draw the results of our UMAP, which clearly separates our cells intro different groups. But this doesn’t mean anything until we cluster.
We will be making a lot of UMAPs going forward.
Relatively new approach (2018) and is generally used more than tSNE now. Though it sometimes faces criticism we find it does a good job on most data sets. It allows a comprehensible 2D visualization of your result.
For a detailed explanation and discussion of dimension reduction approaches here are some resources:
We will have a quick look first at how to run the clustering, using the FindClusters() function. We just need to provide our Seurat object and a resolution.
## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
##
## Number of nodes: 8381
## Number of edges: 314488
##
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.9170
## Number of communities: 15
## Elapsed time: 0 seconds
Looking at the UMAP we can see good separation of clusters. But there may be room for improvement.
To identify the best resolution for each dataset we iteratively test potential resolutions using clustree.
library(clustree)
reso <- c(0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1)
reso_res <- lapply(1:length(reso), function(x, seu_obj, reso) {
seu_obj <- FindClusters(seu_obj, resolution = reso[x])
clust <- setNames(seu_obj$seurat_clusters, Cells(seu_obj))
return(clust)
}, seu_obj, reso)
## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
##
## Number of nodes: 8381
## Number of edges: 314488
##
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.9701
## Number of communities: 8
## Elapsed time: 0 seconds
## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
##
## Number of nodes: 8381
## Number of edges: 314488
##
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.9538
## Number of communities: 11
## Elapsed time: 0 seconds
## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
##
## Number of nodes: 8381
## Number of edges: 314488
##
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.9411
## Number of communities: 12
## Elapsed time: 0 seconds
## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
##
## Number of nodes: 8381
## Number of edges: 314488
##
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.9282
## Number of communities: 14
## Elapsed time: 0 seconds
## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
##
## Number of nodes: 8381
## Number of edges: 314488
##
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.9170
## Number of communities: 15
## Elapsed time: 0 seconds
## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
##
## Number of nodes: 8381
## Number of edges: 314488
##
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.9066
## Number of communities: 16
## Elapsed time: 0 seconds
## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
##
## Number of nodes: 8381
## Number of edges: 314488
##
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.8967
## Number of communities: 16
## Elapsed time: 0 seconds
## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
##
## Number of nodes: 8381
## Number of edges: 314488
##
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.8880
## Number of communities: 17
## Elapsed time: 0 seconds
## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
##
## Number of nodes: 8381
## Number of edges: 314488
##
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.8800
## Number of communities: 17
## Elapsed time: 0 seconds
## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
##
## Number of nodes: 8381
## Number of edges: 314488
##
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.8722
## Number of communities: 19
## Elapsed time: 0 seconds
Some newer Macs have issues with clustree. Installing tweenr directly should help.
To identify the best resolution for each dataset we iteratively test potential resolutions.
## k1 k2 k3 k4 k5 k6 k7 k8 k9 k10
## PBMC_8k_AAACCTGAGCATCATC-1 3 6 6 6 6 6 6 5 5 4
## PBMC_8k_AAACCTGAGCTAACTC-1 2 1 1 1 1 1 1 6 6 5
Lets retry clustering with our improved resolution.
## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
##
## Number of nodes: 8381
## Number of edges: 314488
##
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.9066
## Number of communities: 16
## Elapsed time: 0 seconds
We can see that we have slightly more clusters. We can now compare back to the original clustering, and there are some clearly defined clusters, which weren’t there before.
DimPlot(seu_obj, group.by = "seurat_clusters", label = TRUE, pt.size = 0.2) + NoLegend() +
ggtitle("Optimized Clusters")
We can see that we have slightly more clusters. We can now compare back to the original clustering, and see that cluster 12 is clearly defined now, where it wasn’t before.
DimPlot(seu_obj, group.by = "cluster_byDefault", label = TRUE, pt.size = 0.2) + NoLegend() +
ggtitle("Default Clusters")
Often empty droplets can still make their way past Cell Ranger, or we might see an issue in the Cell Ranger web report itself (or in downstream steps). If this happens we might want to do custom filtering outside of Cell Ranger.
One cause of these issues could be ambient RNAs. Ambient RNAs from lysed cells make empty droplets seem like they contain a cell or contaminate droplets that already have a cell.
Lets look at the PBMC 8k data from 10X Genomics as an example to deal with these issues. This time we will use the raw matrix. This way we don’t use the filtering that Cell Ranger does.
CellBender is a command line toolkit developed to eliminate technical artifacts from scRNA-Seq data such as empty droplets and ambient RNAs link.
In the current version, it contains remove-background module, which is applied to: * Detect empty droplets and ambient RNAs from raw count matrix in CellRanger output. * Remove any droplets considered to be empty, correct the interference of ambient RNAs.
We take the raw matrices from Cell Ranger and run CellBender. The cuda argument will speed up the function, but requires your run it on a GPU.
[This would be run through Terminal on a HPC]
input_h5=the_raw_matrix_in_h5_format_from_cellranger #essential
output_h5=assign_the_h5_file_path_for_the_cellbender_corrected_matrix # essential
fpr=threshold_of_FALSE_POSITIVE_RATE # default 0.01
epochs=number_of_epochs_to_train # default 150
num_train=number_of_times_to_attempt_to_train_the_model # default 1. would speed up while setting greater
cellbender remove-background --input $input_h5 --output $output_h5 --fpr $fpr --epochs $epochs --num-training-tries $num_train --cuda
The h5 file produced by CellBender is currently incompatible with Seurat. We can use the following function to convert the h5 file to a Seurat object.
CellBender has a guide how to convert the h5 file to a Seurat object here, using PyTables. This is another command line tool.
We have some processed results here from CellBender. We can compare this to our filtered matrix from Cell Ranger.
We are going to try out a few tools and approaches. We want to wrap some of our analysis steps into a function to simplify rerunning things.
Normalization: * Log normalization with scale factor = 10,000 * Find Variable features with vst, select top 2000 variable features
Make clusters: * Scale data with ScaleData() * Principle Component Analysis by using RunPCA() with npcs=30 PCs * Make non-linear dimensional reduction in UMAP by using RunUMAP() with dims=1:10 * Estimate Neighbors by using FindNeighbors() with dims=1:10 * Identify clusters with FindClusters() by using resolution=0.5
quick_clust <- function(seu) {
set.seed(42)
seu <- RunPCA(seu, npcs = 30, verbose = FALSE)
seu <- RunUMAP(seu, reduction = "pca", dims = 1:10, verbose = FALSE)
seu <- FindNeighbors(seu, reduction = "pca", dims = 1:10, verbose = FALSE)
seu <- FindClusters(seu, resolution = 0.5, verbose = FALSE)
return(seu)
}
## used (Mb) gc trigger (Mb) max used (Mb)
## Ncells 9783284 522.5 14880925 794.8 14880925 794.8
## Vcells 158903127 1212.4 430539743 3284.8 418206017 3190.7
Like everything scRNAseq is imperfect. Often cellular debris makes its way into a droplet.
We can find a lot of these bad droplets by looking for a high percentage of mitochondrial counts.
The PercentageFeatureSet() function can be used to estimate the percentage of all counts that belong to a set of features. These features can be given as a vector or as a pattern.
If we give a vector we have to make sure the given genes are detected in the Seurat object. They may have been filtered out.
mt_gene <- c("MT-ND1", "MT-ND2", "MT-ND3", "MT-ND4", "MT-ND4L", "MT-ND5", "MT-ND6",
"MT-CO1", "MT-CO2", "MT-CO3", "MT-ATP6", "MT-ATP8", "MT-CYB")
mt_gene_det <- mt_gene[mt_gene %in% rownames(seu_cbFilt)]
seu_cbFilt[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(seu_cbFilt, features = mt_gene_det)
summary(seu_cbFilt$percent.mt)
## Min. 1st Qu. Median Mean 3rd Qu. Max.
## 0.000 2.148 2.765 3.985 3.764 100.000
We can also use regular expression pattern matching to define our feature sets. This is often easier, but may not be possible, depending on your organism.
seu_cbFilt[["percent.mt2"]] <- PercentageFeatureSet(seu_cbFilt, pattern = "^MT-")
summary(seu_cbFilt$percent.mt2)
## Min. 1st Qu. Median Mean 3rd Qu. Max.
## 0.000 2.148 2.765 3.985 3.764 100.000
We can double check that this matches easily by comparing the percentages.
library(ggplot2)
dat <- data.frame(byPattern = seu_cbFilt$percent.mt, byGene = seu_cbFilt$percent.mt2,
stringsAsFactors = FALSE)
cor_val <- cor.test(dat$byPattern, dat$byGene, method = "spearman")
ggplot(dat, aes(x = byPattern, y = byGene)) + geom_point() + geom_smooth() + labs(x = "% of MT, est by genes",
y = "% of MT,est by pattern", subtitle = paste0("rho=", round(cor_val$estimate,
3), "; p-value=", cor_val$p.value[1])) + theme_classic()
## Warning in cor.test.default(dat$byPattern, dat$byGene, method = "spearman"):
## Cannot compute exact p-value with ties
## `geom_smooth()` using method = 'gam' and formula = 'y ~ s(x, bs = "cs")'
The cell cycle can have a massive impact on gene expression variation across a population and is rarely a signature we are trying to find in our data. We can use several methods to regress out these signatures. But, before we do that we need to estimate the cell cycle phase of every cell.
In this step, we will introduce two methods to estimate cell cycle phase for each cell. - The CellCycleScoring function in Seurat - Cyclone function in scran
To estimate the cell cycle phase we need a list of genes that correspond to each cell cycle phase. Seurat does provide these in a list called cc.genes, which contains S-phase and G2/M-phase genes for humans.
## [1] "MCM5" "PCNA" "TYMS" "FEN1" "MCM2" "MCM4"
## [7] "RRM1" "UNG" "GINS2" "MCM6" "CDCA7" "DTL"
## [13] "PRIM1" "UHRF1" "MLF1IP" "HELLS" "RFC2" "RPA2"
## [19] "NASP" "RAD51AP1" "GMNN" "WDR76" "SLBP" "CCNE2"
## [25] "UBR7" "POLD3" "MSH2" "ATAD2" "RAD51" "RRM2"
## [31] "CDC45" "CDC6" "EXO1" "TIPIN" "DSCC1" "BLM"
## [37] "CASP8AP2" "USP1" "CLSPN" "POLA1" "CHAF1B" "BRIP1"
## [43] "E2F8"
## [1] "HMGB2" "CDK1" "NUSAP1" "UBE2C" "BIRC5" "TPX2" "TOP2A"
## [8] "NDC80" "CKS2" "NUF2" "CKS1B" "MKI67" "TMPO" "CENPF"
## [15] "TACC3" "FAM64A" "SMC4" "CCNB2" "CKAP2L" "CKAP2" "AURKB"
## [22] "BUB1" "KIF11" "ANP32E" "TUBB4B" "GTSE1" "KIF20B" "HJURP"
## [29] "CDCA3" "HN1" "CDC20" "TTK" "CDC25C" "KIF2C" "RANGAP1"
## [36] "NCAPD2" "DLGAP5" "CDCA2" "CDCA8" "ECT2" "KIF23" "HMMR"
## [43] "AURKA" "PSRC1" "ANLN" "LBR" "CKAP5" "CENPE" "CTCF"
## [50] "NEK2" "G2E3" "GAS2L3" "CBX5" "CENPA"
The CellCycleScoring() function the scores each cell based on specific features for S-phase/G2M-phase. For a given cell with significant high S.Score or G2M.Score they are assigned as S/G2M. Cells with low both S.Score and G2M.Score were assigned as G1.
This will overestimate cells in S-/G2M-phases in the tissues with low cell cycle i.e. neurons.
We will be focusing on our log normalized results, so first we need to make that the active assay.
DefaultAssay(seu_cbFilt) <- "RNA"
seu_cbFilt <- CellCycleScoring(seu_cbFilt, s.features = feat_s, g2m.features = feat_g2m)
## Warning: The following features are not present in the object: MLF1IP, not
## searching for symbol synonyms
To assess our assignment we can check the score given for each cell, against what phase it was assigned to. To do this we need to make a data frame of scores.
dat_s <- data.frame(cell_id = Cells(seu_cbFilt), cat = "S_Score", Phase = seu_cbFilt$Phase,
score = seu_cbFilt$S.Score)
dat_g2m <- data.frame(cell_id = Cells(seu_cbFilt), cat = "G2M_Score", Phase = seu_cbFilt$Phase,
score = seu_cbFilt$G2M.Score)
dat <- rbind(dat_s, dat_g2m)
dat$Phase <- factor(dat$Phase, levels = c("G1", "S", "G2M"))
We can see in both S and G2/M scores are highest in cells with the corresponding assignment.
ggplot(dat, aes(x = Phase, y = score, fill = Phase)) + geom_violin() + labs(x = "",
y = "Score", fill = "Phase") + facet_wrap(~cat) + theme_classic()
An alternative approach is to use the cyclone() function in scran. This is much slower than CellCycleScoring() in Seurat.
The first step is to convert our Seurat object to a SinlgeCellExperiment object. This is a Bioconductor specific format for single cell data.
library(scran)
sce <- as.SingleCellExperiment(seu_cbFilt, assay = "RNA")
rowData(sce)$SYMBOL <- rownames(sce)
## class: SingleCellExperiment
## dim: 33694 8845
## metadata(0):
## assays(2): counts logcounts
## rownames(33694): RP11-34P13.3 FAM138A ... AC213203.1 FAM231B
## rowData names(1): SYMBOL
## colnames(8845): PBMC_8k_GCAGTTAGTTCCATGA-1 PBMC_8k_CCTTCCCTCATCTGTT-1
## ... PBMC_8k_AGCGTATTCGCCAGCA-1 PBMC_8k_GGGTTGCGTCGTCTTC-1
## colData names(12): orig.ident nCount_RNA ... Phase ident
## reducedDimNames(2): PCA UMAP
## mainExpName: RNA
## altExpNames(0):
We also need a list of genes that correspond to each cycle stage. Cyclone does not just assume that unassigned cells are G1. Instead it uses G1-specific genes to actively assign cells to 3 groups, G1, S and G2/M.
Cyclone requires a list as an input. The first slot contains the names of each group of genes i.e. G1, S and G2/M. The remaining slots contain the relevant genes for each group.
We have the list here for you to load in.
load("data/ccGene_mouse_human_geneSymbol_ensemblID_20220817.RData")
ccGene_hs <- ccGene_mm_hs$human_symbol
lapply(ccGene_hs, function(x) {
head(x, 2)
})
## $G1
## first second
## 1 GNAI3 PWP1
## 2 GNAI3 ASF1B
##
## $S
## first second
## 1 GNAI3 SSR4
## 2 GNAI3 RAB11A
##
## $G2M
## first second
## 1 GNAI3 TSG101
## 2 GNAI3 CDC6
We just provide the the SingleCellExperiment object, the cell cycle gene list, and also a vector of all gene names.
Remember! This is slow. We have a processed result you can also load in.
Cyclone estimates the score for each phase in each cell. It will then assign the cell cycle phases by the highest score
## $phases
## [1] "G1" "G2M" "G1" "G1" "G1" "G1"
##
## $scores
## G1 S G2M
## 1 1.000 0.344 0.000
## 2 0.006 0.078 0.891
## 3 1.000 0.097 0.004
## 4 0.999 0.085 0.012
## 5 1.000 0.511 0.000
## 6 0.998 0.056 0.011
##
## $normalized.scores
## G1 S G2M
## 1 0.744047619 0.25595238 0.000000000
## 2 0.006153846 0.08000000 0.913846154
## 3 0.908265213 0.08810173 0.003633061
## 4 0.911496350 0.07755474 0.010948905
## 5 0.661813369 0.33818663 0.000000000
## 6 0.937089202 0.05258216 0.010328638
We can take our Cyclone results and assign them back into our orignal Seurat object.
Again, we assess our assignment by checking the score given for each cell, against what phase it was assigned to. We must first make a data frame of scores.
dat_g1 <- data.frame(cell_id = Cells(seu_cbFilt), cat = "cyclon_G1Score", Phase = seu_cbFilt$cyclon_Phase,
score = seu_cbFilt$cyclon_G1Score)
dat_s <- data.frame(cell_id = Cells(seu_cbFilt), cat = "cyclon_SScore", Phase = seu_cbFilt$cyclon_Phase,
score = seu_cbFilt$cyclon_SScore)
dat_g2m <- data.frame(cell_id = Cells(seu_cbFilt), cat = "cyclon_G2MScore", Phase = seu_cbFilt$cyclon_Phase,
score = seu_cbFilt$cyclon_G2MScore)
dat <- rbind(dat_g1, dat_s, dat_g2m)
dat$Phase <- factor(dat$Phase, levels = c("G1", "S", "G2M"))
dat$cat <- factor(dat$cat, levels = c("cyclon_G1Score", "cyclon_SScore", "cyclon_G2MScore"))
We can see in both S and G2/M scores are highest in cells with the corresponding assignment.
ggplot(dat, aes(x = Phase, y = score, fill = Phase)) + geom_violin() + labs(x = "",
y = "Score", fill = "Phase") + facet_wrap(~cat) + theme_classic()
## Warning: Removed 363 rows containing non-finite outside the scale range
## (`stat_ydensity()`).
Cell Cycle Phase determined by Seurat::CellCycleScoring()
##
## G1 G2M S
## 3713 2771 2361
Cell Cycle Phase determined by scran::cyclone()
##
## G1 G2M S
## 8386 229 102
Compare the two method: Seurat in row and scran in column
##
## G1 G2M S
## G1 3447 95 45
## G2M 2650 85 34
## S 2289 49 23
Doublets mean multiple cells clumped in the same single droplet. This is a problem: * A doublet may have many more UMIs and Genes in a single cell barcode than the overall population. * Multiple marker genes can be detected in doublets at the same time, even if they are mutually exclusive.
Scrublet is a tool to detect doublets. * The GitHub link * Original Paper on bioRxiv link * It’s based on python. But we can use reticulate to invoke scrublet in R.
We can install the scrublet easily using the Herper package. This uses reticulate to manage miniconda, a repository of tools from which we can install scrublet.
First, we need the Seurat counts as an input for scrublet.
As scrublet is a python tool, we use slightly different nomenclature to what we are used to for R functions.
Similar to the Cell Cycle scoring, we get a score and an assigment from scrublet.
Doublet score
## Min. 1st Qu. Median Mean 3rd Qu. Max.
## 0.00416 0.05194 0.08621 0.11890 0.14172 0.88750
Doublet Count
##
## FALSE TRUE
## 8352 493
We can just assign our results into our Seurat object.
We can use violin plots to check our doublet predictions make sense.
As expected out doublets (TRUE) have higher, doublet scores, UMIs (nCount), genes (nFeature) compared to singlets (FALSE).
VlnPlot(seu_cbFilt, group.by = "doublet", features = c("doublet_score", "nCount_RNA",
"nFeature_RNA"), pt.size = 0)
There are many aspects to determining the quality of your scRNAseq dataset. You can see we have already made several plots to descirbe features of the data. These help guide additional QC steps. We will dig more into that later.
For now we will show you several ways to plot the data and the various metrics we have to try and assess the state of our dataset.
We can use violin plots to check the distribution of specific variables such as: + UMIs (nCount_RNA) per cell + Genes detected (nFeature_RNA) per cell + Ratio of UMIs of mitochondrial genes to nucleus genes (percent.mt)
If a bimodal distribution is identified, we need to check for any interference as it suggests that there could be multiple populations within our dataset. This could be biological (i.e very different cell types) or technical (doublets). We can see some evidence of bimodality in our dataset here.
Scatter plots can be used to look for interactions between specific variables, like we did earlier. Here we compare UMIs and genes detected per cell: * UMIs (nCount_RNA) and the genes detected (nFeature_RNA) should be in high correlation * Doublets with high UMIs and high genes detected.
We can use the same approach with different variables to compare between UMI counts and the percent of mitochondrial content: * Potential cell debris would show low UMI counts (nCount_RNA) and high percentage of mitochondrial genes (percent.mt)
Comparison between UMI counts and the percent of mitochondrial
content: * Potential cell debris would show low UMI counts
(nCount_RNA) and high percentage of mitochondrial genes
(percent.mt)
Another plot you will also often see is a ridge/joy plot. These are evry similar to violins we have already made.
Another plot you will also often see is a ridge/joy plot. These are evry similar to violins we have already made.
## Picking joint bandwidth of 0.0198
Once we have described and annotated our data, we can start to enact our quality control methods to filter out bad cells and correct confounding variables.
Cell debris are with high percent.mt and low UMI counts. Generally, we set various cut-off on percent.mt: * In most scRNA cases, we set the percent.mt > 10 (95% of overall population) * For several specific tissues with high oxygen consumption, like activated leukocytes or muscles, we set the percent.mt > 25. * For single-nuclei profiling, we should not get any UMIs originated from mitochondrial genes. We set the percent.mt > 1.
The doublets detected by Scrublet shall also be removed at this step.
How many cells will be removed:
##
## FALSE TRUE
## 8088 757
Filtering the cells:
Though we have filtered out the most extreme problem cells we will likely still have confounders in our dataset. These are unexpected variables contribute to a high percent of the variances.
# First let's replace NA values in the cyclon phase columns because ScaleData
# doesn't like this
cyclone_cols_numeric <- c("cyclon_G1Score", "cyclon_G2MScore", "cyclon_SScore")
# For each numeric column, replace NA with 0
for (col_name in cyclone_cols_numeric) {
seu_filt@meta.data[[col_name]][is.na(seu_filt@meta.data[[col_name]])] <- 0
}
pot_conf <- c("percent.mt", "doublet_score", "cyclon_G1Score", "cyclon_SScore", "cyclon_G2MScore")
seu_filt <- ScaleData(seu_filt, vars.to.regress = pot_conf)
Once we have defined clusters, we want to know what distinguishes them. We can identify marker genes for each cluster by using Seurat::FindAllMarker().
In this case we are selecting only positive markers (only.pos=TRUE), genes that are found in 0.25 of cells and have a logFC 0.25 difference.
## p_val avg_log2FC pct.1 pct.2 p_val_adj cluster gene
## RPL31 0 0.7077770 0.997 0.989 0 0 RPL31
## RPL35A 0 0.5494061 0.999 0.991 0 0 RPL35A
## RPS3A 0 0.5203382 1.000 0.993 0 0 RPS3A
## RPS6 0 0.6406802 1.000 0.993 0 0 RPS6
## RPS15A 0 0.5376731 1.000 0.993 0 0 RPS15A
## RPL32 0 0.5446820 1.000 0.994 0 0 RPL32
We can review the results with a heatmap. We will first select the top 2 genes for each cluster by log2FC.
top_genes <- markers %>%
group_by(cluster) %>%
slice_max(n = 2, order_by = avg_log2FC)
head(top_genes)
## # A tibble: 6 x 7
## # Groups: cluster [3]
## p_val avg_log2FC pct.1 pct.2 p_val_adj cluster gene
## <dbl> <dbl> <dbl> <dbl> <dbl> <fct> <chr>
## 1 1.08e-173 2.45 0.334 0.075 3.64e-169 0 FHIT
## 2 1.64e- 93 1.95 0.252 0.073 5.51e- 89 0 LINC01550
## 3 0 3.39 0.368 0.035 0 1 QPCT
## 4 0 3.29 0.482 0.049 0 1 ASGR1
## 5 0 7.56 0.575 0.006 0 2 VPREB3
## 6 0 7.50 0.455 0.016 0 2 IGLC2
We can then use the DoHeatmap() from Seurat to plot just these genes.
## Warning in DoHeatmap(seu_filt, features = top_genes$gene): The following
## features were omitted as they were not found in the scale.data slot for the RNA
## assay: MALAT1, AAK1
We can use the FeaturePlot() function to look at the expression of speicfic genes i.e. Naive CD4 T-cell
Here is another example with NK cells.
We can also check the expression of markers in each cluster. First, we need to get our count data and our full list of markers.
Next we need to extract out the counts per cluster for our genes of interest. Here we use an lapply to iterate over every cluster, extracting counts and getting the average for each gene of interest.
clust <- unique(seu_filt$seurat_clusters)
clust <- as.character(clust)
avgExp_byClust <- lapply(clust, function(clust, seu, known) {
sub <- subset(seu, subset = seurat_clusters == clust)
mat <- GetAssayData(sub, assay = "RNA", slot = "data")
mat <- mat[known, ]
mat <- as.matrix(mat)
avg <- rowMeans(mat)
return(avg)
}, seu_filt, known_marker)
names(avgExp_byClust) <- paste0("C", clust)
Finally we get to draw a heatmap with pheatmap(). We need a matrix for this, so we first stick our results from each cluster together.
We can then manually annotate the clusters based on these markers. We do this manually based on the average expression of markers in the cluster. We will show you how to automate this later.
seu_filt[["cellType_byClust"]] <- NA
seu_filt$cellType_byClust[seu_filt$seurat_clusters %in% c(0)] <- "Naive CD4+ T cells"
seu_filt$cellType_byClust[seu_filt$seurat_clusters %in% c(4)] <- "Memory CD4+ T cells"
seu_filt$cellType_byClust[seu_filt$seurat_clusters %in% c(3)] <- "CD8+ T cells"
seu_filt$cellType_byClust[seu_filt$seurat_clusters %in% c(7)] <- "NK cells"
seu_filt$cellType_byClust[seu_filt$seurat_clusters %in% c(9, 11)] <- "DC"
seu_filt$cellType_byClust[seu_filt$seurat_clusters %in% c(8)] <- "FCGR3A+ Monocytes"
seu_filt$cellType_byClust[seu_filt$seurat_clusters %in% c(2)] <- "B cells"
seu_filt$cellType_byClust[seu_filt$seurat_clusters %in% c(1, 6)] <- "CD14+ Monocytes"
seu_filt$cellType_byClust[seu_filt$seurat_clusters %in% c(12)] <- "Platelets"
seu_filt$cellType_byClust[is.na(seu_filt$cellType_byClust)] <- "Unspecified"
Cell numbers in each cell type
##
## B cells CD14+ Monocytes CD8+ T cells DC
## 1117 1666 1024 263
## FCGR3A+ Monocytes Memory CD4+ T cells NK cells Naive CD4+ T cells
## 211 933 263 1483
## Platelets Unspecified
## 54 1074
The Loupe browser is a tool for visualization of Cell Ranger cloupe files.
It provides t-sne visualization of your single-cell data alongside sample/cell information as well as methods to test and visualize changes in gene expression.
Loupe browser can be freely downloaded from the 10x website.
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We can export our seurat objects to a cloupe file using the loupeR package from 10X. This package is available on their github. Once installed we need agree to the license by running the setup function.
We can then create a loupe file from our seurat object really easily using the create_loupe_from_seurat() function.
The exported Loupe file will contain all dsicrete annotations we have added to our Seurat object i.e. Cell Cycle Phase, Cluster etc.
Having downloaded the Loupe browser we can load our cloupe files directly in and rapidly visually interrogate our data.
We have a full guide into how to use and work with Loupe Browser here
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We have based our workflow on the Seurat vignettes and OSCA book from Bioconductor.
UMAPS: * Data Science blog post * Bioinformatic presentation - Babraham Institute * Limitations